碳青霉烯類抗菌藥物一直是產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺 酶（ESBLs）或 AmpC 酶的腸桿菌科細(xì)菌治療首選藥 物，也被認(rèn)為是最后的防線 。隨著該類抗菌藥物 的 廣 泛 使 用 ，臨 床 耐 碳 青 霉 烯 類 腸 桿 菌 科 細(xì) 菌 （CRE）菌株對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率逐年升 高，這在很大程度上限制了該類抗菌藥物的使用，造 成了藥物使用的困難 。

1 材料與方法 

1. 1 菌株來源

收集 2018 年 1—12 月重慶市某三 甲醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)腸桿菌科細(xì)菌1 202株。陽 性對照菌株為 5 株重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院分離 的碳青霉烯酶基因陽性肺炎克雷伯菌，包括 bla KPC-2、 bla IMP-1、bla VIM-2、bla NDM-1和 bla OXA-48 5 種基因型，陰性對 照菌株為實驗室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌 ATCC 25922。

1. 2 儀器與試劑

儀器：VITEK-MS 質(zhì)譜儀和 VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定藥敏儀（均為法 國生物梅里埃公司生產(chǎn)），GNP29270 型恒溫培養(yǎng)箱 （上海精宏實驗室設(shè)備有限公司生產(chǎn)），CFX96 熒光 定量 PCR 擴增儀和 Bio-Rad ChemiDoc XRS 凝膠成 像系統(tǒng)（均為美國 Bio-Rad 公司生產(chǎn)），BG-subMIDIv）可見光電泳—透射儀（北京百晶公司生產(chǎn)）。試 劑：血瓊脂平皿購于英國 OXOID 公司，VITEK-MS CHCA基質(zhì)液購于法國生物梅里埃公司，Premix Taq? 酶和 DNA Marker 均購于大連寶生生物公司，5 種基 因的引物由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1. 3 CRE 菌株鑒定及藥敏試驗

將 61 株 CRE 菌株 均經(jīng) VITEK-MS 質(zhì)譜儀鑒定到種，再通過 VITEK-2 Compact 進(jìn)行藥敏試驗，并用最小抑菌濃度（MIC）法 測定其對 14 種常用抗菌藥物的敏感性，參照 2018 版 CLSI-M100 標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果，本研究將對亞胺培南耐 藥的腸桿菌科細(xì)菌定義為 CRE，并對各種抗菌藥物 耐藥率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1. 4 檢測 CRE 菌株的碳青霉烯酶基因

（1）模板 制備：CRE 菌株 DNA 采用煮沸法提取，放-20 ℃冰箱 保存?zhèn)溆?。?）碳青霉烯酶基因的 PCR 檢測：以 CRE 菌 株 DNA 為 模 板 分 別 對 bla KPC-2、bla IMP-1、bla VIM-2、 bla NDM-1 和 bla OXA-48 5 種基因型進(jìn)行 PCR 擴增，反應(yīng) 條件參照進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系 為 25 μL，包括 12. 5 μL Taq PCR Master Mix，2 μL 上 下游引物，1 μL DNA 模板，9. 5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng) 條件為先 94 ℃預(yù)變 5 min，再 94 ℃變性 30 s，55 ℃退 火 30 s，72 ℃延伸 30 s 或者 60 s（具體根據(jù)產(chǎn)物長度 而定）；變性、退火、延伸 30 個循環(huán)；最后 72 ℃繼續(xù)延 伸 7 min。將 PCR 擴增產(chǎn)物置于 2. 0%瓊脂糖凝膠電 泳25 min，然后再通過凝膠成像儀觀察結(jié)果。（3）碳 青霉烯酶基因測序：將 PCR 擴增陽性的產(chǎn)物送深 圳華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序所得 的序列與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 序列比 對，將相似度最高的基因型作為待測細(xì)菌的基因 類型。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 WHONET 5. 6 軟件進(jìn)行統(tǒng) 計分析。

2 結(jié) 果

2. 1 CRE 菌株鑒定及藥敏試驗結(jié)果

采用 WHONET 5. 6 軟件對藥敏資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，分離得到61 株 CRE 菌株，其中肺炎克雷伯菌 51 株（83. 6%）、 陰溝腸桿菌 6 株（9. 8%）、大腸埃希菌 4 株（6. 6%）， 61 株 CRE 菌株的科室及種類分布；同時，藥 敏結(jié)果顯示，61 株 CRE 菌株對 14 種抗生素的耐藥率 分別為亞胺培南（100. 0%），氨芐西林/舒巴坦（100. 0%）， 頭孢曲松（100. 0%），頭孢他啶（100. 0%），頭孢替坦 （91. 5%），頭孢吡肟（93. 9%），哌拉西林/他唑巴坦 （91. 5%），氨曲南（95. 5%），復(fù)方新諾明（81. 3%），慶 大霉素（81. 3%），妥布霉素（73. 2%），環(huán)丙沙星（79. 3%）， 左旋氧氟沙星（58. 5%），阿米卡星（57. 7%），61 株 CRE 菌株對臨床常用抗生素呈高度耐藥，除了對左旋氧 氟沙星和阿米卡星的耐藥率低于 60.0%，對大部分抗 生素的耐藥率都大于80.0%。

2. 2 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

61 株 CRE 菌株中 共檢測出 bla KPC-2 基因型 50 株，bla NDM-1 基因型 9 株， bla OXA-48基因型4株，未檢測出bla IMP-1基因型和bla VIM-2 基因型。

3 討 論

腸桿菌科細(xì)菌作為社區(qū)和院內(nèi)感染的重要病原 菌，可引起呼吸道、尿路以及菌血癥等各種部位的感 染。碳青霉烯類抗菌藥物對大多數(shù)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰 胺酶和質(zhì)粒介導(dǎo)的 AmpC 酶具有較高的穩(wěn)定性，是 目前治療革蘭陰性菌抗菌譜最廣、抗菌活性最強的 一類抗菌藥物。但是隨著該類藥物大量使用甚至過 度治療，臨床耐藥現(xiàn)象已在腸桿菌科細(xì)菌中開始出 現(xiàn)，并呈逐年增加趨勢，且耐藥范圍已從歐洲、北美 等地區(qū)擴大到中國，菌種也擴展至多種不同種屬的 腸桿菌科細(xì)菌 。2018 年全院共 分離出 61 株 CRE 菌株，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷 伯菌 51 株，占 83.6%，說明該院主要感染 CRE 菌株呈 優(yōu)勢性病原菌感染流行趨勢，這與 CHINET 中國細(xì) 菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計結(jié)果基本一致。該情況仍值得 臨床密切關(guān)注并采取有效的控制措施，避免重復(fù)給 藥、超適應(yīng)證給藥等錯誤行為的發(fā)生。

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