腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，目前惡性腫 瘤的治療方法主要有手術(shù)切除、化療和放療?；?作為一種主要手段，存在藥物選擇性低、不良反應(yīng) 大、藥物水溶性低的缺點(diǎn)，這其中也包括紫杉烷類 抗腫瘤藥物———多西他賽，以上缺點(diǎn)限制了其在臨 床中的應(yīng)用。光敏膠束納米制劑具有高藥物負(fù) 載率、血液長循環(huán)及高通透性和滯留效應(yīng)、良好的 可控性和可調(diào)節(jié)性，使藥物能更安全有效地進(jìn)入腫 瘤組織、提高治療效果，而成為聚合物膠束納米藥 物載體研究的重點(diǎn)，光療－化療聯(lián)合治療比單純 的化療藥 物 有 更 好 的 穩(wěn) 定 性 和 更 高 的 治 療 效 果。 但是，大多數(shù)光化學(xué)反應(yīng)由紫外光源誘導(dǎo)產(chǎn)生，有 低穿透性、組織損傷的缺點(diǎn)，限制了它們作為刺激 源在藥物釋放領(lǐng)域的應(yīng)用。

１ 材料

１．１ 儀器

Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ 高效液相色譜儀（美國 Ａｇｉｌｅｎｔ公司），ＡＲ１１４０ 型 電 子 天 平 （梅 特 勒－托 利 多儀器公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），Ｚ３６ＨＫ 高速冷凍離心機(jī)（德國貝托 特·哈默機(jī)械制造股份公司），Ｔ２５數(shù)顯勻漿機(jī)（德國 ＩＫＡ 實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司），ＱＬ－８６６旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），ＭＤ２００－２型氮?dú)獯?掃儀（杭州奧盛儀器有限公司），ＴＤＬ－８０－２Ｂ 臺(tái)式離 心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，離心半徑 １３．５ｃｍ）， 昆山舒美KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器廠）， Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 超純 水 系 統(tǒng) （美 國 Ｍｉｌｆｏｒｄ 公 司），０～１５０ ｍｍ 數(shù)顯游標(biāo)卡尺（上海臺(tái)海工量具有限公司），Ｅ－ ＣＬＩＰＳＥ８０ｉ型熒光顯微鏡（日本 Ｎｉｋｏｎ公司），ＹＤ－ ２５０８Ｂ 型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè) 備廠），ＳＹＤ－ＰＫ 型漂片機(jī)、ＳＹＤ－Ｂ型組織石蠟包埋 機(jī)（沈陽譽(yù)得電子儀器有限公司）。

１．２ 試藥

三氯甲烷（分析純，天津市凱通化學(xué)試 劑有限公司，２００４１１０４），甲醇（色譜純，天津四友精 細(xì)化學(xué)品有限公司，４０１３２１），０．９％氯化鈉注射液 （浙江濟(jì)民制藥有限公司，０９０３２３８３），肝素鈉（美國 Ｂｉｏｓｈａｒｐ公司），多西他賽（純度＞９９％，北京怡禾生 物工程有限公司，ＦＰ２００９０３０１）。

１．３ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ＫＭ 小鼠（１８～２０ｇ，雌雄各半，河 南省實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 中 心，合 格 證 號(hào)：ＳＣＸＫ（豫）２０１１－ ０００１，許可證號(hào)：ＳＹＸＫ（豫）２０１１－０００１），鼠源腹水 瘤 細(xì) 胞 Ｓ１８０ 細(xì) 胞 株 （中 國 科 學(xué) 院 細(xì) 胞 庫， ＨＹＣ３２０４）。

２ 實(shí)驗(yàn)方法

２．１ 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的 Ｓ１８０細(xì)胞株，將其快速 復(fù)蘇并注入健康小鼠腹部，每只注射０．２ｍＬ 細(xì)胞 懸液，培養(yǎng)鼠源Ｓ１８０細(xì)胞備用。

２．２ 荷瘤小鼠模型的構(gòu)建

從小鼠腹部抽取 腹 水，用０．９％ ＮａＣｌ注射液將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為２ ×１０６個(gè)／ｍＬ，按每只小鼠０．１ｍＬ的細(xì)胞懸液量接 種于 ＫＭ 小鼠右側(cè)頸背部皮下。正常飼養(yǎng)并密切 觀察 ＫＭ 小鼠的健康狀況。接種后若有腫塊樣鼓 包形 成，則 說 明 造 瘤 成 功。腫 瘤 體 積 在 ６０～１００ ｍｍ３（一般情況下為接種后６ｄ左右），可作為動(dòng)物 模型使用。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，并記錄小鼠 的體質(zhì)量變化。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積 Ｖ（ｍｍ３）＝１／２×ａ×ｂ２，其中ａ為腫瘤的長徑， ｂ為腫瘤的短徑。

２．３ 生物樣品中藥物含量測定方法的建立

２．３．１ 色 譜 條 件

色 譜 柱：ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱 （２５０ ｍｍ × ４．６ｍｍ，５μｍ）；預(yù)柱：ＧｕａｒｄＣｏｌｕｍｎＣ１８柱 （１０ｍｍ × ４．６ｍｍ，１０μｍ）；柱溫：３０ ℃；流動(dòng)相∶ 甲醇－水（７５∶２５）；流速：１ｍＬ·ｍｉｎ－１；檢測波長：２２９ ｎｍ；進(jìn)樣量：２０μＬ。

２．３．２ 樣品的處理

血漿制備：（１）將每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 的血漿樣品置于放有肝素的１．５ｍＬ聚丙烯離心管 中，５０００ｒ·ｍｉｎ－１離心１０ｍｉｎ，精密吸取上清液置 于１．５ｍＬ聚丙烯離心管中于－２０ ℃貯存，備用。 （２）器官勻漿液制備：取小鼠瘤，用０．９％ ＮａＣｌ 注射液洗滌去血，濾紙吸干水分，于－２０ ℃貯存?zhèn)?用。精密稱取各組織適量，加入３倍量的水，玻璃勻 漿器勻漿。 精密吸取０．２ｍＬ血漿或器官勻漿液，加入２ｍＬ 甲基叔丁基醚，渦旋混合３ｍｉｎ，于１２０００ｒ·ｍｉｎ－１離 心１０ｍｉｎ，取上層液并將其置于４０℃氮?dú)庀麓蹈?，?入０．２ｍＬ甲醇復(fù)溶后，在已知色譜條件下進(jìn)樣。 取空白血漿及組織樣品２００μＬ 置于５ｍＬ 離 心管中，分別加入配制好的不同濃度的 ＤＴＸ 溶液 １０μＬ，渦 旋 混 合 均 勻，得 到 含 ＤＴＸ 質(zhì) 量 濃 度 為 ０．１０１，０．２０２，０．５０５，１．０１，５．０５，１０．１，２０．２ μｇ·ｍＬ－１的血漿及腫瘤組織樣品。加入２ｍＬ甲基 叔丁基醚，渦旋振蕩２ｍｉｎ混勻，經(jīng)４０００ｒ·ｍｉｎ－１ 離心１５ｍｉｎ，取上清，４０ ℃氮?dú)獯蹈?，加２０?mu;Ｌ 流 動(dòng)相 復(fù) 溶，渦 旋 振 蕩 １ ｍｉｎ，１００００ｒ·ｍｉｎ－１ 離 心 ５ｍｉｎ，取上清進(jìn)樣。

２．３．３ 方法學(xué)考察

２．３．３．１ 專屬性

精密吸取處理后的樣品２０μＬ 進(jìn)樣，記錄色譜圖及 ＤＴＸ的峰面積，ＤＴＸ的保留時(shí) 間大約為６．２５ｍｉｎ，分離度較好，內(nèi)源性物質(zhì)并不 影響 ＤＴＸ的測定，見圖１。

２．３．３．２ 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取空白血漿或腫瘤組 織勻漿０．５ｍＬ，分別加入１００μＬ不同濃度的 ＤＴＸ 儲(chǔ)備液，配 制 成 有 不 同 濃 度 ＤＴＸ 的 生 物 樣 品，按 “樣品的處理”進(jìn)行處理和測定，高效液相記錄色譜 圖及 ＤＴＸ 的峰面積，以 ＤＴＸ 的峰面積對(duì) ＤＴＸ 的 濃度進(jìn)行線性回歸，血漿及腫瘤組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線在 ０．１０１～２０．２０μｇ·ｍＬ－１范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

３ 結(jié)果

本文將疏 水 性 藥 物 ＤＴＸ 制 成 磁 光 敏 膠 束 納 米制劑 Ｃ６０／Ｆｅ３Ｏ４－ＵＣＮＰｓ＠ＤＴＸ＠ＳＮＳＣ，對(duì) 該 制 劑在 ＫＭ 荷瘤小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布藥效學(xué) 進(jìn)行考察。Ｆｅ３Ｏ４的 磁 靶 向 特 性 可 將 納 米 復(fù) 合 物 成功靶向到 腫 瘤 部 位，提 高 藥 物 在 腫 瘤 部 位 的 聚 集，ＵＣＮＰｓ可為藥物釋放及活性氧的產(chǎn)生提供能 量。采用 ＨＰＬＣ法測定血漿和腫瘤組織內(nèi)的 ＤＴＸ 血藥濃度，其專屬性、線性、回收率、精密度及穩(wěn)定 性良好。


 

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