體細(xì)胞核移植技術(shù)在農(nóng)業(yè)家畜育種和人類 (Homo sapiens)疾病動(dòng)物模型的建立等領(lǐng)域具有重 要的價(jià)值。小鼠（Mus musculus)器官大小和各項(xiàng)生 理指標(biāo)均與人類相差較大，無法準(zhǔn)確的模擬人類的 生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 與人類無論是進(jìn)化角度還是具體生理指標(biāo)等在各 個(gè)方面都極為相似，但是其資源匱乏，飼養(yǎng)費(fèi)用昂 貴，再加上倫理道德問題，極大限制了非人靈長(zhǎng)類 在科學(xué)研究中的應(yīng)用。選擇豬(Sus scrofa)作為轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物模型，能更有效地模擬人類的生長(zhǎng)、發(fā)育和 疾 病 發(fā) 生 等 生 理 病 理 過 程 (Robert, 2005; Houdebine, 2009; Herreros-Villanueva et al., 2012)。

1 材料與方法

1.1 材料

分子實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑無特殊說明均購自TaKaRa 公司（大連)，化學(xué)試劑無特殊說明均購自Sigma公 司（美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑無特殊說明均為Gibco（美國(guó))。實(shí)驗(yàn)豬（Sus scrofa)來自中國(guó)科學(xué)院廣州 生物醫(yī)藥與健康研究院醫(yī)用豬大動(dòng)物基地，所用細(xì) 胞由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良 學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離凍存。所用豬卵從廣州市屠宰場(chǎng)取 回后由本實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)成熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TALEN構(gòu)建和體外活性檢測(cè)

1.2.1.1 TALEN設(shè)計(jì)及構(gòu)建

根據(jù) Tiki1 基因外顯子 4 設(shè)計(jì) 1 對(duì) TALEN 質(zhì) 粒，TALEN 質(zhì)粒的組裝和活性檢測(cè)交由北京唯尚 立德生物公司完成。

1.2.1.2 TALEN體外活性檢測(cè)

體外檢測(cè)TALEN活性采用的是單鏈復(fù)性（single-strand annealing, SSA)方法，通過檢測(cè)熒光素酶 活性，預(yù)測(cè)TALEN的切割活性，重復(fù)3次。

1.2.2 TALEN質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒 mMESSAGE SP6（Ambion, 美國(guó)) 和大腸桿菌(Escherichia coli) Poly（A) Polymerase （NEB, 美國(guó))的操作步驟進(jìn)行。

1.2.3 孤雌激活胚的制備

將成熟卵母細(xì)胞放入融合液，進(jìn)行平衡，將平 衡好的胚胎移入融合槽內(nèi)，進(jìn)行電脈沖刺激。胚胎 融合的同時(shí)激活。

1.2.4 TALEN mRNA胞質(zhì)注射

用 顯 微 操 作 系 統(tǒng) 注 射 針 將 1~2 pL TALEN mRNA 注射進(jìn)胚胎細(xì)胞質(zhì)，并放入豬合子培養(yǎng)液 (porcine zygote medium-3, PZM-3)中置于培養(yǎng)箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備提供）。 胚胎培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.2.5 體外胚胎鑒定

根據(jù)豬Tiki1基因序列及設(shè)計(jì)的質(zhì)粒的打靶序 列，用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序鑒定。引物序列：F：5' -CTGCTGAGCTACCAGGGAAC-3'；R：5' -ATGTCCTGGAGGTTCTCACC - 3'。 PCR 反 應(yīng) 體 系 (25 μL)：2×Premix Tag 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游 引物分別為 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩選及鑒定

1.2.6.1 轉(zhuǎn)染

取約 1×107 個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，加入 TALEN質(zhì)粒與pcDNA 3.1質(zhì)粒各50 μg，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀共轉(zhuǎn) 染 豬 胎 兒 成 纖 維 細(xì) 胞 (porcine fetal fibroblasts, PFFs）。

1.2.6.2 篩選

電轉(zhuǎn)后細(xì)胞分裝到15個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，隔天 換為含遺傳霉素(geneticin, G418)的細(xì)胞培養(yǎng)基，篩 選8~10 d后，挑取細(xì)胞克隆。

1.2.6.3 細(xì)胞克隆的PCR鑒定

細(xì)胞克隆采用 PCR 產(chǎn)物測(cè)序鑒定方法(同 1.2.5)。PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測(cè)序。 

2 結(jié)果與分析

根據(jù)哈佛大學(xué)兒童醫(yī)學(xué)院賀熹教授團(tuán)隊(duì)提供的人 Tiki1 基因的完整的 cDNA 序列(Zhang et al., 2012)，在豬的基因組數(shù)據(jù)庫里比對(duì)，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的豬 Tiki1基因位于第3號(hào)染色體上，其預(yù)測(cè)的外顯子4 序列與人 Tiki1 基因的同源性最高，因此在預(yù)測(cè)的 豬 Tiki1 基因外顯子 4 設(shè)計(jì) 1 對(duì) TALEN (TALEN-L 和TALEN-R)，具體序列。把體外轉(zhuǎn)錄的 TALEN mRNA 分別以 0、4、20 和100 ng/µL注射到豬的孤雌激活胚中，體外培養(yǎng) 到囊胚，檢測(cè)囊胚率和打靶效率。對(duì)照組注射等體 積的 H2O 內(nèi)含 0 ng/µL TALEN mRNA，注射 135 個(gè) 豬孤雌激活胚后共計(jì)獲得囊胚 58 個(gè)，囊胚發(fā)育率 為42.9% (58/135)；當(dāng)注射的TALEN mRNA為4 ng/ µL濃度時(shí)，注射160個(gè)豬孤雌激活胚后共計(jì)獲得囊 胚 44 個(gè)，囊胚發(fā)育率為 27.5% (44/160)；當(dāng)注射的 TALEN mRNA 為 20 ng/µL 濃度時(shí)，注射 160 個(gè)豬 孤雌激活胚后共計(jì)獲得囊胚 47 個(gè)，囊胚發(fā)育率為 29.4% (47/160)；當(dāng)注射的TALEN mRNA為100 ng/ µL濃度時(shí)，注射160個(gè)豬孤雌激活胚后共計(jì)獲得囊 胚32個(gè)，囊胚發(fā)育率為20.0% (32/160)(表1)。以上 結(jié)果說明，隨著TALEN mRNA注射的濃度的增大， 對(duì)豬孤雌胚的發(fā)育影響較小。

3 討論

Tiki1基因是哈佛大學(xué)兒童醫(yī)學(xué)院賀熹教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一個(gè)對(duì)蛙頭部的誘導(dǎo)起到?jīng)Q定性作用 的新基因(Zhang et al., 2012)，近年來 Tiki1 基因作 為 Wnt 信號(hào)通路中新的抑制因子(Zhang et al., 2016a; Zhang, He, 2016)進(jìn)入了人們的視野,但Tiki1 在小鼠等嚙齒類動(dòng)物中缺失(Bazan JF et al., 2013)， 因而無法利用嚙齒類動(dòng)物模型研究Tiki1基因在哺 乳動(dòng)物發(fā)育過程中的作用。而且小鼠等嚙齒類實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物模型在器官大小、解剖結(jié)構(gòu)等各方面均與人 類有很大差異，現(xiàn)已建立的小鼠疾病模型大多只能 模擬人類疾病的部分癥狀，阻礙了對(duì)人類疾病的發(fā) 病機(jī)理和治療方法的研究(Vodicka et al., 2005)。