高原地區(qū)空氣稀薄，大氣氧含量低，可誘發(fā)心、 腦、肺等多臟器的缺氧損傷，大腦特別是海馬組 織對(duì)缺氧最為敏感。隨著人類(lèi)在高原地區(qū)的生 活、工作及旅游的日益廣泛，急性高原病、健忘、注意 力不集中、記憶力衰退等，越來(lái)越多地困擾著人們的 工作與生活，其嚴(yán)重程度與海拔高度、居住時(shí)間、海 拔上升速度以及個(gè)人體質(zhì)等密切相關(guān)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠 144 只，體 重( 200 ± 20) g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì) 第九四〇醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SYXK( 軍) 2017-0046。飼養(yǎng)室溫度為( 25 ± 2) ℃， 相對(duì)濕度為 40% ～ 60% 。所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行 喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。

1. 2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1. 2. 1 實(shí)驗(yàn)試劑

4% 多聚甲醛( Biosharp) ; BCA 蛋 白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、 4 × 蛋白質(zhì)上樣緩沖液( 含 DTT) 、脫脂奶粉、SDS、 Tris、Glycine、10 × TBST( 以上試劑均購(gòu)自北京索萊 寶科技有限公司) ; ＲIPA 裂解液和 PMSF( 均購(gòu)自碧 云天生物技術(shù)研究所) ; PageＲuler Prestained Protein Ladder ( Thermo Scientific ) ; Anti-HIF-1α 抗 體-ChIP Grade( Abcam) ; 小鼠 β-actin 單克隆抗體、辣根酶標(biāo) 記山羊抗小鼠 lgG( H + L) 、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 lgG( H + L) ( 以上均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司) ; 無(wú)水甲醇( 成都市科隆化學(xué)品有限公司) ; PVDF 膜( Immobilon-P Transfer Membranes) ; Carestream 醫(yī)用 X 射線膠片( 廈門(mén)銳珂醫(yī)療器材公司) ; 通用顯影粉 和酸性定影粉( 均購(gòu)自天津市世紀(jì)奧博商貿(mào)公司) ; WesternBright ECL( A 液和 B 液) ( Advansta ( USA) 公司) 等。

1. 2. 2 實(shí)驗(yàn)儀器

E200 型光學(xué)顯微鏡( 日本 Nikon 公司) ; FLYDWC50-ⅡC 低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙( 貴州 風(fēng)雷航空軍械有限公司) ; Tissuelyser-24 多樣品組織 研磨機(jī)( 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司) ; 3K15 型高 速冷凍離心機(jī)( Sigma 公司) ; SpectraMax  i3 型全 自動(dòng)熒 光 酶 標(biāo) 儀 ( 美 國(guó) Molecular Devices 公 司) ; BP210S 型電子天平( 德國(guó) Sartorius 公司) ; DK-8A 型電熱恒溫水槽( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ; ErpacTM Basic 基礎(chǔ)電泳儀電源和小型垂直電泳槽、 Trans-Blot  TurboTM Transfer system 半 干 轉(zhuǎn) 儀 ( BIO-ＲID) 等。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 不同缺氧海拔暴露與分組

選取 72 只 SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠隨機(jī)分為常氧空白組 ( 海 拔 1500 m) 、缺 氧 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、 8000 m 組，每組 12 只，常氧空白組置于飼養(yǎng)室( 海 拔 1500 m，蘭州) ，并將缺氧組大鼠按組別放入低壓 低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，以10 m /s的速度分別將艙內(nèi)海 拔升高到 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、8000 m， 缺氧暴露時(shí)間設(shè)置為 12 h。缺氧結(jié)束后，迅速解剖 取材，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，固定缺氧暴露損傷最嚴(yán)重的海 拔高度。

1. 3. 2 不同缺氧時(shí)間暴露與分組

當(dāng)缺氧暴露海拔 確定后，另取 72 只 SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠隨機(jī)分為 常氧空白組( 0 h) 、缺氧 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h 組，每組 12 只。將缺氧組大鼠按組別放入低壓低氧 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，以 10 m /s 的速度將艙內(nèi)海拔升高到 上一組實(shí)驗(yàn)確定的海拔，缺氧暴露時(shí)間分別設(shè)置為 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h。缺氧暴露后立即解剖取 材檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，確定缺氧暴露損傷最嚴(yán)重的時(shí)間。

1. 3. 3 海馬組織樣本采集

不同條件缺氧暴露后立 即將大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，斷頭處死， 然后各組隨機(jī)抽取大鼠 2 只剖取大腦，放入 4% 多 聚甲醛中進(jìn)行固定，用以制備組織切片。剩余大鼠 剖取海馬組織，按組別分裝標(biāo)記后于 － 80℃ 冰箱中 存放備用。

1. 3. 4 海馬組織切片的制備

經(jīng)過(guò)固定的大鼠大腦 組織標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋后，6 μm 切片，裱于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包埋的清潔載玻片上，常規(guī)進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、 磷酸鹽緩沖液( PBS) 洗滌及蘇木精 － 伊紅( HE) 染 色，觀察海馬組織的病理形態(tài)。

1. 3. 5 海 馬 組 織 中 HIF-1α 的 蛋 白 表 達(dá)

采 用 Western Blotting 法檢測(cè)。稱(chēng)取海馬組織約 50 mg，加 入 500 μl 的 ＲIPA 裂解液( 含 1% PMSF) 提取總蛋 白，并采用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度。所制備的蛋白樣 品于 － 80℃ 冰箱中存放。取樣品 20 ～ 50 μg 進(jìn)行 SDS-PAGE 電 泳。濃 縮 膠 濃 度 為 5% ，80 V 電 泳 40 min，分離膠濃度為 10% ，110 V 電泳 80 min，半 干法轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)條件根據(jù)目的蛋白分子量不同而進(jìn) 行設(shè)置，β-actin 為 18 V，15 min; HIF-1α 為 20 V， 15 min。轉(zhuǎn)膜完畢，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，以 4℃ 搖床孵育一抗過(guò)夜，一抗?jié)舛确謩e為 β-actin ( 1 ∶ 1000) 、HIF-1α( 1∶ 1000) 。第 2 天，采用 1 × TBST 洗膜( 共 6 次，每次 8 min) 后，室溫?fù)u床孵育二抗， 二抗?jié)舛葹槔备笜?biāo)記山羊抗兔或抗小鼠 lgG( 1∶ 5000) 2 h，再次洗膜，ECL 顯影曝光。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 24． 0 處理 數(shù)據(jù); Image-Pro Plus 6． 0 軟件對(duì)曝光圖片進(jìn)行灰度 掃描測(cè)定并進(jìn)行結(jié)果分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn) 差( x ± s) 表示，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的兩 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。α = 0． 05 為檢 驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

常氧空白組大鼠海馬組織呈正常 形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列整齊、完整，神經(jīng)元輪廓清晰，多 呈圓形，細(xì)胞核大而圓，著色較淺，位于細(xì)胞中央，細(xì) 胞核和細(xì)胞質(zhì)邊界清晰易辨。缺氧組大鼠海馬組織 水腫、疏松; 神經(jīng)元呈不同程度的變性、壞死，以及大 量周?chē)窠?jīng)空泡; 并且隨著缺氧海拔增高和缺氧時(shí) 間延長(zhǎng)，海馬組織損傷愈嚴(yán)重。7500 m 海拔缺氧暴露對(duì)大鼠 海馬組織中 HIF-1α 表達(dá)的影響最明顯。故固定缺 氧 7500 m 不同缺氧時(shí)間暴露后發(fā)現(xiàn)，各 缺 氧 組 HIF-1α 的表達(dá)與常氧空白組相比有顯著性差異 ( P ＜ 0. 01) 。隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，缺氧 6 h 至 24 h 時(shí) HIF-1α 表達(dá)呈升高趨勢(shì)，缺氧 ＞ 24 h 后 HIF-1α 表達(dá)可達(dá)到平臺(tái)期。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用低壓低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙模擬高原環(huán)境，研究不同高原缺氧暴露條件對(duì)大鼠海馬組織病 理學(xué)及 HIF-1α 的影響; 結(jié)果顯示，常氧空白組大鼠 海馬組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，但是隨著缺氧海 拔升高及缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，海馬組織結(jié)構(gòu)疏松、水腫， 神經(jīng)元呈不同程度的變性、壞死。HIF-1α 蛋白表達(dá) 在 3000 m 組缺氧 12 h 后與常氧空白組比較差異無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 但在海拔 4500 m、6000 m、7500 m 缺氧 環(huán)境下 HIF-1α 蛋白表達(dá)逐步升高，并有顯著性差 異，進(jìn)一步升高到 8000 m 時(shí)則有所下降。另一方 面，7500 m缺氧環(huán)境下，隨著缺氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)， HIF-1α蛋白表達(dá)呈升高趨勢(shì)，缺氧 24 h、36 h、72 h 時(shí)，HIF-1α 蛋白表達(dá)水平可達(dá)到平臺(tái)期。說(shuō)明隨著 缺氧海拔高度的升高，缺氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，7500 m 缺氧大于 24 h，HIF-1α 蛋白表達(dá)達(dá)到最大值，機(jī)體 缺氧損傷最嚴(yán)重。



 

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問(wèn)題需要我方刪除，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們會(huì)在第一時(shí)間進(jìn)行處理。