阿爾茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）又稱遺忘型癡呆癥，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患 者的認(rèn)知、記憶以及社會(huì)生活能力 ．ＡＤ的發(fā)病機(jī)制一直是研究者密切關(guān)注的問(wèn)題，其中主要涉及膽堿能 功能障礙、Ａβ淀粉樣蛋 白、氧化應(yīng)激及自由基損傷等 ．目 前 臨 床 治 療 ＡＤ 主 要 采 用 以 乙 酰 膽 堿 酯 酶 （ＡＣｈＥ）為藥物靶點(diǎn)的乙酰膽堿酯酶抑制劑（ＡＣｈＥｌｓ）；另有研究指出，氧化應(yīng)激可能會(huì)增加自由基的水平， 從而導(dǎo)致 Ａβ淀粉樣蛋白升高，因此清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的自由基或成為治療 ＡＤ的新方向．

在日照海域采集野生牡蠣，通過(guò)分離純化得到共生細(xì)菌．

（ｇ／１００ｍＬ）．ＬＢ液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨１ｇ，酵母浸粉０．５ｇ，過(guò)濾滅菌海水１００ｍＬ，ＰＨ 自 然；ＬＢ固體培養(yǎng)基：ＬＢ液體培養(yǎng)基 ＋１．６ ％ 瓊脂粉．

恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），恒溫生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），ＰＣＲ儀（美國(guó)ＢＩＯ－ＲＡＤ），多功能檢測(cè)儀（美國(guó)Ｂｉｏｔｅｋ公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限 公司）；細(xì)菌基因組 ＤＮＡ 提取試劑盒、ＰＣＲ擴(kuò)增等試劑均購(gòu)自天根生化科技有限公司，碘代硫代乙酰膽堿（ＡＴＣＩ）、乙酰膽堿酯酶（ＡＣｈＥ）及 ＤＴＮＢ，１，１－ 二苯基 －２－ 三硝基苯肼（１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ） 等試劑均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司．

將新鮮野生牡蠣于７５％ 酒精中浸泡３０－６０ｓ，無(wú)菌海水潤(rùn)洗３次，稱?。保?ｇ牡蠣肉于１００ｍＬ滅菌海水中浸泡，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１ 振蕩４５ｍｉｎ，勻漿，過(guò)濾得牡蠣菌懸液．無(wú)菌條件下從菌懸 液中吸?。保?mu;Ｌ至三角瓶中，滅菌海水補(bǔ)足至５００ｍＬ，得到１０－１ 的菌液，然后梯度稀釋分別得到１０－２、１０－３、 １０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９ 菌液．吸?。保埃?mu;Ｌ上述各濃度菌液均勻涂布于ＬＢ固體培養(yǎng)基上，置于３７℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，定期觀察，分離純化得到單一菌落．

參照文獻(xiàn)提取已分離純化菌株的ＤＮＡ，以２７Ｆ／１４９２Ｒ為引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò) 增，ＰＣＲ反應(yīng)條件為：預(yù)變性９５℃３ｍｉｎ→ 變性９５℃４５ｓ→ 退火５５℃４５ｓ→ 延伸７２℃５０ｓ→ 充分延伸 ７２℃１０ｍｉｎ→ 保存１６℃２ｍｉｎ→ 循環(huán)擴(kuò)增３５次，?。?mu;ＬＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其余送蘇州金 唯智生物科技有限公司測(cè)序．

將分離出的菌株接種至 ＬＢ液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng) （３６ｈ，３７ ℃，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１）．離心發(fā)酵液（６５００ｒ獉ｍｉｎ－１，２５ｍｉｎ）取上清，２倍體積乙酸乙酯萃取３次，合并 乙酸乙酯層，濃縮得粗浸膏，將上述粗浸膏溶于 ＤＭＳＯ，配置成５ｍｇ·ｍＬ－１ 溶液備用．

參照文獻(xiàn)采用改良 Ｅｌｌｍａｎ法測(cè)定其對(duì) ＡＣｈＥ 的抑制活性．磷酸緩沖溶液（０．１ ｍｏｌ獉Ｌ－１，ＰＨ＝８．０），ＡＣｈＥ（０．０５Ｕ獉ｍＬ－１），ＤＴＮＢ（０．０６６７ｍｏｌ獉Ｌ－１），ＡＴＣＩ（０．１ｍｍｏｌ獉Ｌ－１）．?。粗В?ｍＬＥＰ管，設(shè)置空白（Ａ１）、標(biāo)準(zhǔn)（Ａ２），樣品本底（Ａ３），樣品（Ａ４）組．分別加入磷酸緩沖溶液２９５０μＬ、２８８０ μＬ、２９５０μＬ和２８８０μＬ；Ａ１ 和Ａ２ 組中分別加入ＤＭＳＯ１００μＬ；Ａ３ 和Ａ４ 組中加入１００μＬ的待測(cè)樣品溶液； Ａ２ 和Ａ４ 組加入７０μＬ的ＡＣｈＥ溶液．充分混勻，冷藏２０ｍｉｎ后，分別加入１００μＬ的ＤＮＴＢ和２０μＬ的ＡＴＣＩ 溶液，得到最終的反應(yīng)體系．３７ ℃ 水浴反應(yīng)２５ｍｉｎ后，加終止劑０．４％ ＳＤＳ（１００μＬ）．本實(shí)驗(yàn)以鹽酸他克林 （Ｃｏｇｎｅｘ）作為陽(yáng)性對(duì)照．在４１２ｎｍ 處測(cè)得 ＯＤ值，按公式計(jì)算出抑制率 抑制率（％）＝ （Ａ２ －Ａ１）－ （Ａ４ －Ａ３） Ａ２ －Ａ１ ×１００％．

參照文獻(xiàn)方法，采用ＤＰＰＨ自由基清除法測(cè)定牡蠣內(nèi)生細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的 抗 氧化活性．以７５％ 乙醇作為參比溶液調(diào)零，空白組（Ａ０）中加入７５％ 乙醇１００μＬ，ＤＰＰＨ 溶液（０．４ｍｍｏｌ ·Ｌ－１）１００μＬ；樣品組（Ａｉ）中加入待測(cè)樣品２μＬ，７５％ 乙醇９８μＬ，ＤＰＰＨ 溶液１００μＬ；樣品本底組（Ａ１）中 加入待測(cè)樣品２μＬ，７５％ 乙醇１９８μＬ，以抗壞血酸（Ｖｃ）為陽(yáng)性對(duì)照．室溫暗置３０ｍｉｎ后，在最大波長(zhǎng)為５１７ ｎｍ 測(cè) ＯＤ值，按照公式計(jì)算清除率 清除率（％）＝ Ａ０ － （Ａｉ －Ａ１） Ａ０ ×１００％．

菌株部分生理生化等特性參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 進(jìn)行．

通過(guò)對(duì)牡蠣共生細(xì)菌進(jìn)行分離純化、培養(yǎng)，共得到并鑒定出牡蠣共生細(xì)菌６２株．采用通用引物２７Ｆ和 １４９２Ｒ進(jìn) 行 ＰＣＲ 擴(kuò) 增，經(jīng) 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳，基 因 測(cè) 序 結(jié) 果 經(jīng) Ｂｌａｓｔｎ 比 對(duì)，結(jié) 果 表 明，ＨＹＭＬ－１－６、 ＨＹＭＬ－１－２５、ＨＹＭＬ－１－３４ 和 ＨＹＭＬ－１－４４ 菌 株 為 孤 菌 屬；ＨＹＭＬ－１－１１、ＨＹＭＬ－１－２２、ＨＹＭＬ－１－２７、 ＨＹＭＬ－１－３７、ＨＹＭＬ－１－３８ 和 ＨＹＭＬ－１－４０ 菌 株 為 芽 孢 桿 菌 屬；ＨＹＭＬ－１－４、ＨＹＭＬ－１－１２、ＨＹＭＬ－１－１９、 ＨＹＭＬ－１－３１菌株為運(yùn)動(dòng)魯杰 氏 菌；ＨＹＭＬ－１－１５、ＨＹＭＬ－１－１６、ＨＹＭＬ－１－４６ 菌 株 為 黃 桿 菌；ＨＹＭＬ－１－１４、 ＨＹＭＬ－１－２０、ＨＹＭＬ－１－５２菌株為交替單胞菌；ＨＹＭＬ－１－４７菌株為嗜熱脂肪芽孢桿菌；其余４１株菌株為交 替假單胞菌屬，因此，假單胞菌屬為牡蠣共生細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌屬．部分菌株１６ＳｒＲＮＡ 基因序列比對(duì)分析結(jié)果 如表１所示．

ＡＣｈＥ活性篩選 對(duì)牡蠣內(nèi)生細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑制 ＡＣｈＥ活性篩選，結(jié)果如圖１所示，有１３株細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物 粗提物（５μｇ·ｍＬ－１）對(duì) ＡＣｈＥ具有一定的抑制活性，分別為 ＨＹＭＬ－１－３，ＨＹＭＬ－１－６，ＨＹＭＬ－１－９，ＨＹＭＬ－１－１０， ＨＹＭＬ－１－１１，ＨＹＭＬ－１－１２，ＨＹＭＬ－１－１８，ＨＹＭＬ－１－２４，ＨＹＭＬ－１－２６，ＨＹＭＬ－１－２７，ＨＹＭＬ－１－３９，ＨＹＭＬ－１－４７， ＨＹＭＬ－１－６２．其中，ＨＹＭＬ－１－１１和 ＨＹＭＬ－１－６２菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性較強(qiáng)，抑制ＡＣｈＥ活性ＩＣ５０ 分別為５．０１和４．５３μｇ·ｍＬ－１． 

海洋資源因其特殊的環(huán)境，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生一系列獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎和生物活性多樣的特點(diǎn)，因此海洋資源是產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的寶庫(kù) ．研究表明，從 海綿、藻類和海鞘等分離出的海洋細(xì)菌Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓ．ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｓ．ｐａｃｉｆｉｃａ 等，其次級(jí)代謝具有抗癌、 抗菌、抗炎、抗瘧等作用，其中一些已應(yīng)用于臨床，如環(huán)孢菌素Ａ、利福霉素、環(huán)馬林素Ｄ等 ．此外，海洋微 生物中芽孢桿菌屬的成員其次生代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出多種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物活性 ．王鳳舞等從青島海域牡 蠣中分離得到８株內(nèi)生細(xì)菌，然而僅一株細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有乙酰膽堿脂酶抑制活性，本研究從日照海 域野生牡蠣中分離純化得到６２株內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示，其中４株為孤菌屬，６株為 芽孢桿菌屬，４株為魯杰式菌屬，３株為黃桿菌屬，３株為交替單胞菌屬，１株為嗜熱脂肪芽孢桿菌，其余４１株 為交替假單胞菌屬，因此，交替假單胞菌屬為牡蠣內(nèi)生細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌屬．抑制 ＡＣｈＥ 活性和抗氧化活性研究 結(jié)果表明，１３株菌株具有一定的抑制 ＡＣｈＥ活性；２２株菌株顯示較強(qiáng)的ＤＰＰＨ 自由基的清除作用．此外還發(fā) 現(xiàn)，具有 ＡＣｈＥ抑制作用的１３株菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物均顯示較強(qiáng)的抗氧化活性，揭示其次級(jí)代謝產(chǎn)物中含 有潛在的活性物質(zhì)，有望為治療以膽堿能缺乏及自由基過(guò)剩為特征疾病的先導(dǎo)化合物的開(kāi)發(fā)提供一定的理 論依據(jù)。