腎細胞癌簡稱腎癌，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡 性腫瘤之一，全球每年有超過 30 萬例新增患者。 腎癌分別占男性和女性所有惡性腫瘤的5%和3%， 發(fā)病率在男性癌癥患者中排第 7 位，女性癌癥患 者中排第 10 位。目前，腎癌治療的最有效方式是手術(shù)切除。腎癌分多種病理亞型，透明性腎細 胞癌是最常見的一種亞型，約占腎癌的 70%~85%， 其他還有乳頭狀腎細胞癌，約占腎癌 7%~15%；嫌 色細胞癌占 5%~10%，還有少數(shù)具有罕見組織形態(tài) 學(xué)的腎細胞癌<1%。早期腎癌往往不易被察覺，有20%~30%的腎癌患者在檢出時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移 性腎癌患者預(yù)后差，5 年生存率低。一旦腎癌發(fā) 生遠處轉(zhuǎn)移，則失去了手術(shù)切除進行根治的機會， 因此，在腫瘤患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移之前對患者進行 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移性治療至關(guān)重要。

人腎細胞癌786-O和769-P細胞系購于中國科 學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;7 對配對腎癌 及癌旁組織來自浙江省腫瘤醫(yī)院(倫理批件: IRB-2017-2);RPMI 1640 培養(yǎng)基(GIBCOTM,批號: 31800-022);丙酮酸鈉溶液(Sigma,批號:S8636); 青鏈霉素溶液 100×(杭州科易,批號:CP011);胰 酶粉末(GIBCOTM,批號:27250-018);地西他濱 (Sigma,批號:A3656);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide , DMSO , Sigma ,批號: D5879) ; Lipofectamine 3000 Transfection Kit(Thermo Fisher,批號:1946890);總 RNA 提取試劑盒 (Axygen,批號:APMN-MS-RNA-250);RNAsimple 總 RNA 提取試劑盒(天根,批號:DP419); PrimeScriptTM RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara ,批號: DRR036A) ; PrimeScriptTM RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara ,批號: RR037A);SYBRTM Premix Ex TaqTM 實時熒光定量 PCR 試劑盒(Takara,DRR420A);BCA 蛋白濃度 測定試劑盒(碧云天,批號:P0010);RIPA 強裂解 液(碧云天,批號:P0013B);一抗稀釋液(碧云天, 批號:P0023A);鈣黏蛋白抗體(Abcam,批號: ab133597);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(聯(lián) 科,批號:Mab5465);miR-200c 和 miR-141 類似 物由上海吉瑪公司合成。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);生物安全柜(Heal Force);HVE-50 滅菌鍋(HIRAYAMA);顯微鏡 (Nikon);電熱恒溫水槽(上海精宏);高速離心機 (Eppendorff);StepOnePlu 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems);電泳儀(Bio-Rad);制冰機 (SCOTSMAN);超低溫冰箱(Thermo Forma)。

786-O 和 769-P 細胞分別用 0.05%胰酶消化 2 min,培養(yǎng)于含 10%胎牛血清?1×青鏈霉素和 1× 丙酮酸鈉溶液的 1640 培養(yǎng)基,置于 37 ℃,5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每 2~3 d 傳代 1 次?細胞給藥: 地西他濱溶于 DMSO 配制成 25 mmol·L-1 的母液, 786-O 和 769-P 細胞種于 6 孔板,對照組每孔加入 2 mL DMSO,給藥組每孔加入 2 mL 2.5 mmol·L-1 地 西他濱,使終濃度為 2.5 mmol·L-1 ,連續(xù)給藥誘導(dǎo) 3 d?細胞轉(zhuǎn)染:基于 1640 培養(yǎng)基體積計算濃度, 細胞轉(zhuǎn)染 miR-NC?miR-200c 以及 miR-141 的終濃 度為 30 nmol·L-1 ,轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 3000 的 濃度為 2‰。

用 RNAsimple 總 RNA 提取試劑盒提取組織 RNA,用 Axygen 總 RNA 提取試劑盒提取細胞 RNA?Takara RR036A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于 mRNA 的逆轉(zhuǎn)錄,Takara RR037A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于 miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄?miRNA 逆轉(zhuǎn)錄特異性引物序列: miR-200a:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACATCG3’;miR-200b:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCG TGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAT CA-3’;miR-200c:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTC GTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCC

786-O 和 769-P 細胞接種于 6 孔板中,基于 1640 培養(yǎng)基體積計算濃度,加入終濃度為 2.5 μmol·L-1 地西他濱誘導(dǎo) 3 d 或轉(zhuǎn)染 30 nmol·L-1 的 miR-200c/141 2 d 后,用 200 μL 槍頭劃線,PBS 清洗黏附的細胞碎片,培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基? 分別于劃線 0,24 h 后用配置有尼康數(shù)碼照相機的 尼康倒置鏡像顯微鏡進行拍照。

前一晚用空白 1640 培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠,將稀 釋好的基質(zhì)膠溶液加到 Transwell 小室中,第 2 天 吸去 Transwell 小室中液體,可見底部有一層白色 薄膜,即凝固的基質(zhì)膠,Transwell 小室下加入 600 μL 1640 完全培養(yǎng)基? 786-O 和 769-P 細胞接種于 6 孔板中,基于 1640 培養(yǎng)基體積計算濃度,加入終濃度為 2.5 μmol·L-1 地西他濱誘導(dǎo) 3 d 或轉(zhuǎn)染 miR-200c/141 2 d 后,0.05%胰蛋白酶消化計數(shù), 10 000 個細胞每孔種于鋪好膠的 Transwell 小室 中?置于37 ℃,5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h, 吸走培養(yǎng)基,PBS 洗 2 次,4%多聚甲醛固定 1 h, 棉簽拭去小室上層細胞,結(jié)晶紫染色 1 h,PBS 洗 2 次,用配有尼康數(shù)碼照相機的尼康倒置鏡像顯微 鏡進行拍照。

786-O 和 769-P 細胞接種于 6 孔板中,基于 1640 培養(yǎng)基體積計算濃度,加入終濃度為 2.5 μmol·L-1 地西他濱誘導(dǎo) 3 d 后,吸走培養(yǎng)基, PBS 洗 2 次,100 μL RIPA 裂解液提取細胞蛋白, 4 ℃旋轉(zhuǎn) 30 min 充分裂解細胞,12 000 r·min-1 ,4 ℃離心 10 min,BCA 試劑盒測定蛋白濃度,蛋 白質(zhì)印跡法進行檢測?分離膠濃度 10%,濃縮膠 濃度 5%,上樣量 10 μL,電壓 90 V 電泳約 30 min, 電壓 120 V 電泳約 90 min?電泳結(jié)束后取出蛋白 膠,按膠面大小裁剪合適大小的聚偏二氟乙烯膜, 在背面做好標記后浸泡在甲醇中活化,電轉(zhuǎn)夾層 從負極(黑色)至正極(紅色)依次鋪置海綿?濾紙? 蛋白膠?PVDF 膜?濾紙?海綿,將電轉(zhuǎn)夾層按正 確方向組裝于電轉(zhuǎn)槽,加入電轉(zhuǎn)緩沖液至標示指 示線,在冰浴條件下以 200 mA 電轉(zhuǎn) 2 h?電轉(zhuǎn)結(jié) 束后聚偏二氟乙烯膜用 5%奶粉室溫封閉 2 h,一 抗 4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育 2 h,G-BOX 化 學(xué)發(fā)光成像儀顯色曝光。

用 Image J 進行細胞計數(shù)及劃痕面積計算?用 GraphPad Prism 6.0 進行統(tǒng)計分析。

在腎癌組織中顯著下調(diào) 實時熒光定量 PCR 檢測 7 對配對腎癌及癌旁 組織中 miR-200c/141 表達水平,結(jié)果腎癌組織與 其配對癌旁組織相比,miR-200c/141 表達水平均 顯著下調(diào),見圖 1?患者組織信息見表 1

2.2 miR-200c/141

抑制腎癌細胞侵襲遷移 在 786-O 和 769-P 細胞中轉(zhuǎn)染 miR-200c/141， 2 d 后用 200 μL 槍頭劃線，吸走完全培養(yǎng)基，替換 成無血清培養(yǎng)基，分別在 0，24 h 拍照。轉(zhuǎn)染了 miR-200c/141 后，細胞遷移能力顯著減弱，見圖 2。 在 786-O 和 769-P 細胞中轉(zhuǎn)染 miR-200c/141 后， 進行 Transwell 實驗。結(jié)果表明，細胞侵襲能力顯 著下降，見圖 3。因此，miR-200c/141 可以抑制腎 癌細胞系 786-O 和 769-P 的侵襲遷移能力。

3 討論

DNA甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳機制， 在胚胎發(fā)育、細胞增殖以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都 起著重要作用，主要由 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。 基因啟動子區(qū)域甲基化水平調(diào)控基因的表達，在癌癥中，一些抑癌基因的啟動子區(qū)域高甲基化抑 制抑癌基因的表達，原癌基因啟動子區(qū)域低甲基化 促進原癌基因的表達，最終促進癌癥進程。有 研究者認為，DNA 甲基化是藥物治療癌癥的理想 靶點，目前有大量 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑正在研 發(fā)。地西他濱作為 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑已被美 國 FDA 批準用于臨床，通過抑制 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 活性影響基因甲基化水平進而調(diào)控基因的表達。