苦 木 為 苦 木 科 木 本 植 物 苦 木 Picrasmaquas- sioides(D.Don)Benn.的干燥枝和葉,具有清熱解毒 和燥濕殺蟲的功效?苦木含有以生物堿類成分為 主的化學成分,臨床主治感冒?咽喉腫痛和腹瀉下痢 等癥?國內外植物化學及藥理學研究主要集中在 脂溶性 生 物 堿 類 成 分 的 抗 炎?抗腫瘤和降壓等方 面,且對抗炎作用的研究多為口服或注射給藥?本 文對苦木水煎液和脂溶性總生物堿在體外對金黃色葡 萄球菌?銅綠假單胞菌?大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門 菌的最小抑菌 質 量 濃 度(MIC)和最小殺菌質量濃度 (MBC)進行了測定,對苦木水煎液外用抗炎作用進行 研究,為擴大該藥的臨床應用和研究提供參考。

Mettler-ToledoXS105DU 分 析 天 平(瑞士梅特勒-托利多公司);SartoriusBT25S型精密 分析天 平 (賽多利斯科學儀器有限公司);KQ-300 TDB高頻數(shù)控超聲波清洗 器(昆山市超聲儀器有限 公司);SX-500 高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋 (日 本 托 彌 公 司); 1300A2生物安全柜(美國 Thermo公司);生化培養(yǎng) 箱 (上海精宏實驗設備有限公司);Leitz 1512型旋轉 式 切 片 機 (德 國 Leitz 公司);DP-71型 顯微鏡 (日本 Olympus公司)。

苦木水煎液 (質 量 濃 度 為1g·mL-1, 自制);脂溶性總生物堿 (質量濃度為20mg·mL-1,自 制);鹽酸小檗堿(質量濃度為2mg·mL-1,質量分數(shù) >99.00%,批號1170713-201212),購自 中 國 食 品 藥 品 檢 定 研 究 院;丁 酸 氫 化 可 的 松 乳 膏 (批 號 16080313,規(guī)格10g∶10mg),天津金耀藥業(yè)有限公 司;小鼠免疫球 蛋 白 E(IgE)試劑盒及白細胞介素-6 (IL-6)試劑盒(北京雅安達生物技術有限公司);胰酪 大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)(批號20180116)和胰酪大 豆胨瓊脂 培 養(yǎng) 基(TSA)(批號20180214),北京 奧 博 星生 物 技 術 有 限 責 任 公 司;生 理 鹽 水 (批 號L218012411),四川科倫藥業(yè)股份有限公司;2,4-二硝 基 氟 苯 (DNFB,批 號 BCBR8143V,質 量 分 數(shù) ≥ 99%),Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;丙酮(分 析純,質量分數(shù)>99.5%),成都科龍化工試劑廠;橄 欖油(批號2018082201),成都市科隆化學品有限公 司。

金黃色葡萄球菌[菌株編號:CMCC(B) 26003]?銅綠假單胞菌[菌株編號:CMCC(B)10104]? 大腸埃希菌[菌株編號:CMCC(B)44102]?乙型副傷 寒沙門菌[菌株編號:CMCC(B)50094],均購自中國 食品藥品檢定研究院? 1.4 動物 SPF 級昆明種小鼠32只,體質量25~ 30g,由西安交通大學實驗 動 物 中 心 提 供,動 物 合 格 證號:SCXK(陜)2017-003。

將苦木水煎液(1g·mL-1), 脂溶性總 生 物 堿 (20 mg·mL-1)和 鹽 酸 小 檗 堿 (2 mg·mL-1)于實 驗 前 配 制 好 并 經(jīng) 高 壓 蒸 汽 滅 菌,置 于4 ℃冰箱 中,待 用?小 鼠 耳 部 變 應 性 接 觸 性 皮 炎 (ACD)誘導劑 DNFB的稀釋基質為丙酮∶橄欖油= 4∶1,臨 用 前 分 別 配 制 成 濃 度 為 2.5 和 5.0 μL·mL-1的 DNFB溶液。

將金黃色葡萄球菌?銅綠假 單胞菌?大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng) 物分別接種于 TSB中,33 ℃培養(yǎng)18h,再分別用無菌 生理鹽水10倍系 列 稀 釋,使 其 含 菌 量 分 別 為3.2× 106,8.9×105,2.8×106和4.2×106 CFU·mL-1,備用。

采用試管二倍稀釋 法,取滅菌試管10支,于第1~9管各加入 TSB2 mL,然后于第1管中加入苦木水煎液2mL,混勻后 取出2mL 加入第2管中,依此類推,直到第8管 中 取出2mL棄去,第9管作為 TSB對照,第10管作為 苦木水煎液對照?分別于第1~9管中加入制備好的 金黃色葡萄球菌?銅綠假單胞菌?大腸埃希菌和乙型 副傷寒沙門菌菌液0.1mL,搖勻,33 ℃培養(yǎng)24h,以 不出現(xiàn)渾濁的質量濃度作為苦木水煎液的 MIC?將 所有清晰 無 菌 生 長 的 試 管 培 養(yǎng) 液 取 1 mL 接 種 于 TSA 中,33 ℃培養(yǎng)24h,菌落數(shù)不超過5CFU 的質 量濃度作為苦木水煎液的 MBC?以相同的方法測定 脂溶性總生物堿和鹽酸小檗堿的 MIC和 MBC。

將32只小鼠適 應性飼養(yǎng)1周,隨機分為空白對照組?模型組?陽性對 照 組 (丁 酸 氫 化 可 的 松 )和 苦 木 水 煎 液 組 (1 g·mL-1)?于實驗第1日用電剃須刀去除小鼠腹部毛 發(fā),面積 3cm×3cm ;實驗第2日,除空白對照組小鼠于腹部脫毛處涂以生理鹽水外,其余各組小鼠均涂 以含 DNFB5.0μL·mL-1的丙 酮-橄欖 油 液25μL 進行首次致敏;實驗第3日,同樣劑量致敏劑強化致 敏1次;實驗第8日,空白對照組小鼠于左耳背面處 涂生理鹽水20μL,其余各組小鼠在給藥結束2h,于 左耳背面處涂以含 DNFB2.5μL·mL-1的丙酮-橄 欖油液20μL誘發(fā)皮炎,且所有小鼠均于右耳背面處 涂抹丙酮-橄欖油基質20μL作為對照。

各組小鼠均于首次致敏后第2日開始給藥,空白 對照組和模型組小鼠每日于左耳雙面涂抹生理鹽水, 陽性對照組小鼠每日在左耳雙面用棉棒涂抹丁酸氫 化可的松乳膏0.15g,苦木水煎液組涂抹1g·mL-1 的苦木水煎液0.3mL(相當于0.3g,給藥劑量參考 文獻并根據(jù)前期預實驗結果及生藥含量確定)? 每日上午8時 和 下 午4時 各 涂 抹1次,涂 藥 后 稍 按 摩,連續(xù)給藥7d。

小鼠眼球后靜脈叢取血0.5mL,室 溫靜置,以1000r·min-1離心15min,離心后吸取 上層血清,采 用 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附(Elisa)法檢 測 小 鼠 血 清中IgE和IL-6的水平。

第9日 (誘發(fā)皮炎24h后),用游標卡尺測量并記錄各組小 鼠左?右耳中部厚度,計算誘發(fā)皮炎后小鼠左?右耳厚 度差?測量結束后,取小鼠左耳組織片用體積分數(shù)為 10%的甲醛溶液固定,常規(guī)進行石蠟切片后,蘇木精- 伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察耳組織病理學變化。

實 驗 數(shù) 據(jù) 用 x±s 表 示,應 用 SPSS17.0軟件進行t 檢驗 統(tǒng) 計 分 析?P<0.05表 示差異有統(tǒng)計學意義。

鹽酸小檗堿體外 對溶血性鏈球菌?金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等多種 革蘭陽性及陰性菌均具有抑制作用,本實驗以鹽酸小 檗堿為對照藥,分別測定苦木水煎液和脂溶性總生物 堿對金黃色葡萄球菌?銅綠假單胞菌?大腸埃希菌和 乙型副傷寒沙門菌的 MIC和 MBC?   苦木水煎液外用對小鼠耳厚度的影響 空白 對照組小鼠右耳經(jīng)丙酮-橄欖油(4∶1)基質涂抹后與 左耳涂抹生理鹽水比較出現(xiàn)了輕微腫脹,左耳平均厚 度低于右耳?與空白對照組比較,模型組小鼠左耳腫 脹明顯,左右耳厚度差顯著增大(P<0.01)?與模型 組比較,陽性對照組及苦木水煎液組用藥后均能減輕 小鼠耳部腫脹癥狀(P<0.01)。